خالص‌سازی مهارکننده‌های آنزیم آلفا-آمیلاز گوارشی سوسک کلرادو و بید سیب‌زمینی از عصاره پروتئینی بذر چاودار با روش کروماتوگرافی تمایلی
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
1دانشگاه تبریز
2عضو هیئت علمی دانشگاه تبریز
3فارغ التحصیل دانشگاه تبریز
چکیده
سیب‌زمینی یکی از تولیدات مهم کشاورزی در سراسر جهان بوده و در کشور ایران به عنوان ماده‌غذایی مهم شناخته شده است. سوسک کلرادوی سیب‌زمینی (Leptinotarsa decemlineata Say) و بید سیب‌زمینی (Phthorimaea operculella Zeller) جزء مهم‌ترین آفات سیب‌زمینی در نقاط مختلف جهان می‌باشند. ایجاد اختلال در فعالیت آنزیم‌های گوارشی حشرات آفت توسط مهارکننده‌های موجود در بافت‌های گیاهی مورد تغذیه که بخشی از سامانه دفاعی گیاه می‌باشند، یکی از روش‌های کنترل آفات محسوب می‌شود. در این تحقیق، پروتئین مهارکننده آنزیم آلفا-آمیلاز گوارشی این دو حشره آفت از بذر چاودار (Secale cereale L. cv. Danko) با روش کروماتوگرافی تمایلی و با استفاده از ماتریکس دی‌اکسید سیلیکون نانوپودر و روش مبتنی بر سانتریفیوژ خالص‌سازی گردید. بدین منظور تثبیت یا ایموبیلیزاسیون عصاره آنزیم گوارشی لارو سن آخر سوسک کلرادو و بید سیب‌زمینی به عنوان لیگاند به روی دی‌اکسید سیلیکون فعال شده با گلوتارآلدئید (25%) انجام شد. در ادامه عصاره پروتئینی چاودار به‌دست آمده از رسوب‌دهی با سولفات آمونیوم 30-0% که فعالیت آنزیم آلفا-آمیلاز این دو حشره را به ترتیب تا 76 و 79 % مهار کرده بود، روی ماتریکس‌های آماده به صورت جداگانه افزوده شد. فرآیند شست‌و‌شو با بافر فسفات سدیم به ترتیب با اسیدیته 7، با اسیدیته 7 حاوی 1/0 مولار کلرید سدیم و با اسیدیته 11 حاوی 1/0 مولار کلرید سدیم، برای جداسازی به ترتیب پروتئین‌های متصل نشده به ماتریکس، پروتئین‌های متصل شده غیراختصاصی و پروتئین‌های متصل شده اختصاصی هر کدام حداقل با سه بار شست و شو انجام شد. سه فرکشن به‌دست آمده از شست و شوی نهایی با هم ترکیب و در نهایت با استفاده از صافی سانتریفیوژی (10 کیلودالتون) اولترافیلتراسیون صورت گرفت و فرکشن‌ها به حجم مناسب تغلیظ گردیدند. سنجش فعالیت آنزیم آلفا-آمیلاز با استفاده از نشاسته 1% به عنوان زیرنهشت و معرف دی‌نیتروسالیسیلیک‌اسید (DNS) انجام شد. جهت تعیین میزان خلوص پروتئین‌ها، الکتروفورز ژل پلی‌آکریل‌آمید واسرشت‌گر دارای سدیم‌دودسیل‌سولفات (SDS-PAGE) اجرا شد. فرکشن‌های به دست آمده با استفاده از عصاره آنزیمی سوسک کلرادو و بید سیب زمینی در ژل هر کدام به ترتیب حاوی یک نوار پروتئینی با وزن مولکولی در حدود 65 و 50 کیلودالتون بودند. میزان خالص‌سازی پروتئین مهارکننده آلفا-آمیلاز سوسک کلرادوی سیب‌زمینی 10 برابر و بازده آن 10 % و میزان خالص‌سازی پروتئین مهارکننده آلفا-آمیلاز بید سیب‌زمینی 22 برابر و بازده آن 15% به دست آمد. با توجه به نتایج به دست آمده، این روش در خالص‌سازی پروتئین مهارکننده آلفا-آمیلاز سوسک کلرادو و بید سیب‌زمینی از عصاره پروتئینی بذر چاودار روش موفقی بوده است. با شناسائی توالی اسیدهای‌آمینه پروتئین‌های مهارکننده در بذر چاودار و انتقال ژن‌های مرتبط با این پروتئین‌ها به گیاه سیب‌زمینی می‌توان این گیاه را در مقابل آسیب این آفات، مقاوم نمود.
کلیدواژه ها