همسانه سازی و بیان ژن پروتئین حرکتی جدایه ایرانی ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی در Escherichia coli

عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران

جدایـه ایرانـی ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه ‌فرنگی ([Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV-[Ab)، از خسارت‌زاترین ویروس‌های گوجه‌فرنگی در ایران محسوب می‌شود. TYLCV با ژنوم DNA تک حلقوی عضو جنس Begomovirus و خانواده Geminiviridae می‌باشد. ژنوم ویروس [TYLCV-[Ab دارای دو چارچوب خوانش باز شامل V1 و V2 روی رشته ویروسی و چهار چارچوب خوانش باز شامل، C3، C2، C1 و C4 روی رشته مکمل می‌باشد. چارچوب خوانش باز V2 در حرکت ویروس در گیاه نقش دارد. در تحقیق حاضر، پس از استخراج DNA از گیاهان آلوده، ژن پروتئین حرکتی [TYLCV-[Ab در واکنش زنجیره‌ای پلی‌ مراز (PCR) توسط آغازگرهای اختصاصی حاوی محل‌های برشی BamHI و HindIII به ترتیب در انتهای ´5 آغازگرهای ویروسی و مکمل تکثیر شد. نتیجه PCR تکثیـر یک قطعـه DNA مـورد انتظار به اندازه حـدود 350 جفت بـاز بود که پس از جداسازی و خالص سازی از ژل در ناقـل پلاسمیدی pTZ57R/T همسانه‌‌سازی شد. پلاسمید نوترکیب حاصل (pTZ57TYLCV-V2)، جهت تکثیر به باکتری Escherishia coli سویه DH5α انتقال داده شد. صحت همسانه نوترکیب حاصل (pTZ57TYLCV-V2) از طریق تعیین ترادف ژن وارد شده توسط شرکت Macrogen کره جنوبی مورد تایید قرار گرفت. اندازه دقیق ژن مورد نظر 351 جفت باز تعیین شد که با ترادف قطعه مورد نظر ژن پروتئین حرکتی (V2) ویروس [TYLCV-[Ab شباهت 99/99 درصدی نشان داد. ژن مربوطه پس از هضم آنزیمی با آنزیم‌های برشی BamHI و HindIII از pTZTYLCV-V2 بازیابی و به ناقل بیان pET28 انتقـال یافت. پلاسمید نوترکیب بدست آمده (pET28TYLCV-V2) با روش شوک حرارتی به باکتری E. coli سویـه‌ی BL21 (DE3 وارد گردیـد و بـه مـدت یک شب در محیـط LB جامـد حـاوی 100μg/ml انتـی‌بیوتیک آمپیسیلیــن و 25μg/ml آنتی‌بیوتیک کانامایسین کشت داده شد. DNA پلاسمیدهای نوترکیب pET28TYLCV-V2 پس از کشت مجدد باکتری در محیط LB مایع استخراج و وجود قطعه‌ی مورد نظر در آن توسط هضم آنزیمی و انجام PCR با استفاده از آغازگرهـای اختصاصـی مورد تأئید قرار گرفت. در نهایت بیان پروتئیـن حرکتـی (V2) با استفـاده از غلظت‌های مختلف IPTG القا گردید. نمونه‌بـرداری از پـروتئین در غلظت‌ها و ساعات مختلف پس از القا انجام شد. بررسی نمونه-های پروتئینی باکتری ترانسفورم شده با pET28TYLCV-V2 در آزمون الکتروفورز پروتئین با استفاده از ژل پلی‌اکریل آمید و سدیم دودسیل سولفات نشان داد که پروتئین مورد نظر پس از گذشت 3 ساعت از زمان القاء با غلظت 1 میلی‌مولار از ترکیب IPTG با تشکیل یک باند قوی با وزن مولکولی حدود 12 کیلودالتون که با وزن تخمین زده شده برای محصول ژن V2 تطابق داشت، از بقیه پروتئین‌ها قابل تفکیک است. نتیجه این تحقیق نشان داد که پروتئیـن حرکتـی [TYLCV-[Ab در سیستم باکتریایـی بیان مـی‌شود. پـروتئین بیـان شده مـی تواند بـرای تولیـد انبـوه آنتـی‌ژن و نهایتاً تولید آنتی‌بادی، شناسایی جدایه‌های بومی TYLCVو مطالعات برهمکنش ویروس- میزبان مورد استفاده قرار گیرد.

همسانه سازی؛ پروتئین حرکتی؛ آنتی ژن؛ ویروس ایرانی پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی