همسانه‌سازی و بیان ژن پروتئین C4 جدایه ایرانی ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه‌فرنگی در E. coli با استفاده از ناقل بیان pET28

عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران

ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه‌فرنگی (TYLCV) یکی از مخرب‌ترین ویروس‌های بیماری‌زای گوجه‌فرنگی در نواحی گرمسیری و نیمه‌گرمسیری جهان است که در ایران نیز شایع است. علائم بیماری ناشی از این ویروس شامل زردی، پیچیدگی و کوچک شدن برگ‌ها، کوتاه شدن فاصله بین برگ‌ها و کوتولگی گیاه است. این ویروس با ژنوم دی‌ان‌ای تک لای حلقوی، یکی از اعضای تک‌بخشی جنس Begomovirus و تیره‌ی Geminiviridaeمی‌باشد. چارچوب خوانش C4 روی رشته‌ی مکمل ژنوم ویروس، کدکننده‌ی پروتئین C4 است. به‌منظور تکثیر ژن C4 جدایه ایرانی ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه‌فرنگی (TYLCV [Ab])، دی‌ان‌ای کل از گیاهان آلوده استخراج و همراه با یک جفت آغازگر اختصاصی (TYLCV [Ab]) حاوی محل‌های برشی BamHI و HindIII به ترتیب در انتهای ´5 آغازگرهای ویروسی و مکمل در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) استفاده شد. نتیجه PCR، تکثیر یک قطعه دی‌ان‌ای مورد انتظار به اندازه تقریبی 290 جفت باز بود. محصولPCR پس از خالص‌سازی، در ناقل pTZ57R/T همسانه‌سازی شد. پلاسمید نوترکیب حاصل (pTZTYLCV-C4)، به سویه‌ DH5αباکتری Escherishia coli انتقال داده شد. پس از کشت باکتری به -مدت یک شب در دمای ̊C37، دی‌ان‌ای pTZTYLCV-C4 استخراج و صحت همسانه های صحیح با واکنش هضم آنزیمی و تعیین ترادف ژن C4 وارد شده به پلاسمید تائید شد. اندازه دقیق ژن C4، 296 جفت باز تعیین شد. ترادف ژن C4 وارد شده بیشترین شباهت (99% ) را با ژن C4 ویروس TYLCV [Ab]داشت. ژن مربوطه پس از هضم آنزیمی با آنزیم‌های برشی BamHI و HindIII از pTZTYLCV-C4 بازیابی و به ناقل بیان pET28 وارد شد. پلاسمید نوترکیب حاصل ( pETTYLCV-C4) به سلول‌های باکتری E. coli سویه DE3 منتقل گردید و به‌ مدت یک شب بر روی محیط LB جامد حاوی μg/ml100 آمپیسیلین و μg/ml25 کانامایسین کشت داده شد. . به‌منظور اطمینان از ورود قطعه مورد نظر به ناقل بیان، واکنش هضم آنزیمی پس از خالص سازی دی ان ای پلاسمید از کلنی‌های رشد یافته صورت پذیرفت. پس از اطمینان از صحت سازه pETTYLCV-C4 و به‌منظور بیان ژن C4، پلاسمید نوترکیب pETTYLCV-C4 مجدداً با استفاده از روش شوک حرارتی به سلول‌های باکتری E. coliسویه DE3 منتقل گردید. سلول‌های باکتری تراریخت شده به مدت 3 ساعت در دمای ̊C37 در محیط کشت حاوی 1 میلی‌مولار IPTG جهت القای بیان ژن C4 کشت شدند. بررسی بیان پروتئین از طریق الکتروفورز در ژل پلی‌آکریل‌آمید حاوی SDS، یک باند قوی پروتئین با وزن مولکولی 10 کیلو دالتون را مشخص نمود که با وزن تخمین زده شده برای محصول ژن C4 تطابق داشت. بدین ترتیب بیان ژن C4در سیستم باکتریایی انجام شد. بیان ژن C4ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه‌فرنگی می تواند کمک فراوانی به تکمیل تحقیقات مولکولی به‌خصوص مطالعات برهمکنش ویروس-میزبان و شناسایی عمل این پروتئین‌ نماید. بعلاوه امکان استخراج و خالص-سازی پروتئین بیان شده و تولید آنتی‌سرم نوترکیب بر علیه آن وجود دارد.

پلاسمید نوترکیب؛ تعیین ترادف؛ هضم آنزیمی