تعیین نوع پاتوتیپ سویه های ایرانی باکتری مولد شانکر اسیایی مرکبات و بررسی تنوع ژنتیکی انها با استفاده از روش های انگشت نگاری ژنومی rep-PCR و RAPD
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
از مناطق مختلف کشت مرکبات در استان‌های جنوبی شامل استان‌های فارس، کرمان، هرمزگان و سیستان و بلوچستان، بافت‌های مختلف دارای علائم شانکر شامل برگ، شاخه و میوه از درخت لیموترش نمونه برداری شد. همچنین تعدادی میوه لیموترش وارد شده از کشور تایلند موجود در بازار شیراز که علائم شانکر نشان می دادند، جمع اوری شد. باکتری عامل جداسازی و خالص سازی شد. ازمون اثبات بیماریزایی جدایه ها روی لیموترش انجام شد. جدایه‌ها بر اساس ازمونهای فنوتیپی معمول باکتری شناسی و تکثیر قطعه 197 جفت
بازی با جفت آغازگر J-pth1/J-pth2 و تکثیر قطعه 581 جفت
بازی با جفت آغازگر Xac01/Xac02 به عنوان Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) شناسایی شدند. دامنه میزبانی جدایه‌ها روی یازده گونه و رقم مرکبات شامل لیموترش یا مکزیکن لایم، لیمولیسبون، لیموشیرین، نارنج، پرتقال (ارقام والنسیا، ناول و توسرخ) و نارنگی (دو رقم کینو و گلابی)، گریپ‌فروت و پوملو مورد بررسی قرار گرفت. جدایه‌ها فقط روی لیموترش علائم شاخص شانکر ایجاد کردند. با توجه به دامنه میزبانی محدود جدایه‌ها و نیز ردیابی جدایه‌ها با جفت آغازگر Xac01/Xac02، جدایه‌ها به عنوان پاتوتیپ A* شناخته شدند. د ر نهایت 110 جدایه باکتری جهت بررسی تنوع ژنتیکی انتخاب شد. تنوع ژنتیکی جدایه ها با دو روش rep-PCR و RAPD مورد بررسی قرار گرفت. آزمون rep-PCR (repetitive sequenced based-PCR) با استفاده از آغازگرهای ERIC (ERIC1R/ERIC2)، REP (REP1R/REP2I) و BOXA1R و آزمون RAPD (random amplified polymorphic DNA) با استفاده از هشت آغازگر تصادفی 10 نوکلئوتیدی انجام گرفت. یک سویه Xcc تیپ A و یک سویه از Pseudomonas tolaasii نیز جهت مقایسه در این ازمونها استفاده شدند. آنالیز داده‌های حاصل با استفاده از نرم‌افزار GelComparII 6.6.8 انجام گرفت. ابتدا نقوش الکتروفورزی جدایه‌ها با یکدیگر مقایسه شد. وجود یک مارکر خاص با کد یک و عدم وجود آن با کد صفر تعریف شد. لازم به ذکر است در این مرحله فقط باندهای تکرارپذیر امتیازدهی شد. فاصله یا شباهت ژنتیکی بین جدایه‌ها محاسبه شد. تجزیه خوشه‌ای براساس روش مراتبی (Hierachical Technique) انجام و برای بررسی فاصله واقعی میان کلاسترها از روشUnweighted Pair-Group Method using Arithemtic Average (UPGMA) و ضریب تشابه Jaccard استفاده شد. نتایج دو روش تقریبا با یکدیگر مطابقت داشت و بیانگر تشابه تقریباً 81 درصدی جدایه‌های ایرانی و نیز متفاوت بودن جدایه های سیستان و بلوچستان از جدایه های سایر استانها بود. جدایه‌های ایران در مقایسه با جدایه‌های تایلند شباهت بیشتری به سویه تیپ A ( 72درصد) داشتند. جدایه‌ها در سه گروه اصلی شامل جدایه‌های سه استان کرمان، فارس و هرمزگان جدایه‌های استان سیستان و بلوچستان و جدایه‌های تایلند قرار گرفتند.
بازی با جفت آغازگر J-pth1/J-pth2 و تکثیر قطعه 581 جفت
بازی با جفت آغازگر Xac01/Xac02 به عنوان Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) شناسایی شدند. دامنه میزبانی جدایه‌ها روی یازده گونه و رقم مرکبات شامل لیموترش یا مکزیکن لایم، لیمولیسبون، لیموشیرین، نارنج، پرتقال (ارقام والنسیا، ناول و توسرخ) و نارنگی (دو رقم کینو و گلابی)، گریپ‌فروت و پوملو مورد بررسی قرار گرفت. جدایه‌ها فقط روی لیموترش علائم شاخص شانکر ایجاد کردند. با توجه به دامنه میزبانی محدود جدایه‌ها و نیز ردیابی جدایه‌ها با جفت آغازگر Xac01/Xac02، جدایه‌ها به عنوان پاتوتیپ A* شناخته شدند. د ر نهایت 110 جدایه باکتری جهت بررسی تنوع ژنتیکی انتخاب شد. تنوع ژنتیکی جدایه ها با دو روش rep-PCR و RAPD مورد بررسی قرار گرفت. آزمون rep-PCR (repetitive sequenced based-PCR) با استفاده از آغازگرهای ERIC (ERIC1R/ERIC2)، REP (REP1R/REP2I) و BOXA1R و آزمون RAPD (random amplified polymorphic DNA) با استفاده از هشت آغازگر تصادفی 10 نوکلئوتیدی انجام گرفت. یک سویه Xcc تیپ A و یک سویه از Pseudomonas tolaasii نیز جهت مقایسه در این ازمونها استفاده شدند. آنالیز داده‌های حاصل با استفاده از نرم‌افزار GelComparII 6.6.8 انجام گرفت. ابتدا نقوش الکتروفورزی جدایه‌ها با یکدیگر مقایسه شد. وجود یک مارکر خاص با کد یک و عدم وجود آن با کد صفر تعریف شد. لازم به ذکر است در این مرحله فقط باندهای تکرارپذیر امتیازدهی شد. فاصله یا شباهت ژنتیکی بین جدایه‌ها محاسبه شد. تجزیه خوشه‌ای براساس روش مراتبی (Hierachical Technique) انجام و برای بررسی فاصله واقعی میان کلاسترها از روشUnweighted Pair-Group Method using Arithemtic Average (UPGMA) و ضریب تشابه Jaccard استفاده شد. نتایج دو روش تقریبا با یکدیگر مطابقت داشت و بیانگر تشابه تقریباً 81 درصدی جدایه‌های ایرانی و نیز متفاوت بودن جدایه های سیستان و بلوچستان از جدایه های سایر استانها بود. جدایه‌های ایران در مقایسه با جدایه‌های تایلند شباهت بیشتری به سویه تیپ A ( 72درصد) داشتند. جدایه‌ها در سه گروه اصلی شامل جدایه‌های سه استان کرمان، فارس و هرمزگان جدایه‌های استان سیستان و بلوچستان و جدایه‌های تایلند قرار گرفتند.
کلیدواژه ها