بررسی ارتباط بین وجود آنزیم اندوگلوکاناز در قارچ Macrophominaphaseolinaو بیماریزائی جدایه‌ها A survey on relashioship between presence of endoglucanase enzymes in Macrophomina phaseolinaand pathogenicity of its isolates.
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
دیواره سلولی احاطه کننده سلول‌های گیاهی از میکروفیبریل‌های سلولزتشکیل شده است که به صورت ماتریکسی از پلی‌ساکاریدها سازمان‌دهی شده است.از آنجا که دیواره سلولی از اولین و مهم‌ترین موانع بر سر راه نفوذ و گسترش پاتوژن به درون سلول‌های گیاه می-باشد، میکروارگانیسم‌های واجد توانایی کلنیزه و آلوده نمودن گیاهان، بایستی دارای قابلیت تولید آنزیم‌های مورد نیاز برای تجزیه دیواره سلولی باشند. از سوی دیگر محصولات حاصل از تاثیر این آنزیم‌ها بر دیواره‌های سلولی توسط بعضی از میکروارگانیسم‌ها به عنوان منابع غذایی مورد استفاده قرار می‌گیرد. سلولازها گروه مهمی از آنزیم‌های تجزیه کننده دیواره سلولی در گیاهان هستند که بر اساس نحوه فعالیت در سه دسته آنزیم‌های اندوگلوکانازها، آنزیم‌های اگزوگلوکانازها وß-glucosidases قرار می‌گیرند. بیشتر قارچ-های Botryosphaeriales اندوفیت‌های گیاهی هستند که واجد قدرت کلنیزه کردن طیف وسیعی از گیاهان می‌باشند. گونه‌های متعددی از قارچ‌های این راسته از قبیل Macrophomina phaseolina پاتوژن‌های مهم گیاهی هستند که اثرات بیماری زایی مهم و مخربی بر روی میزبان‌های خود ایجاد می نمایند.در این تحقیق، 32 جدایه از قارچ M. phaseolina که از گیاهان دانه روغنی آلوده و از مناطق عمده کشت سویا، آفتابگردان و کنجد در ایران جداسازی شده بودند، از نظر وجود آنزیم‌های اندوگلوکاناز1 و 2مورد بررسی قرار گرفتند.توالی رمز کننده آنزیم‌های اندوگلوکاناز1 و 2 از بانک ژن جهانی (NCBI) گرفته شد.برای انجام PCR، آغازگرها بر اساس نواحی متفاوت بین توالی‌های رمز کننده دو نوع اندوگلوکاناز1 و 2 طراحی شدند.توالی جفت آغازگرهای طراحی شده عبارت است از:
آغازگر برگشتی آغازگر روبه جلو
5'-ACG TTC CAT CAA GAT GTT G-3' 5'-AGT GCA AAA GGA AGA GAA GC-3' Egl1
5'-ACG CCG CCG CAG AGC CAT TAT C-3' 5'-AAC GAC CAG TTC GTC TCG-3' Egl2
همچنین بر اساس نتایج هم‌ردیفی چند گانه بین ژن‌های مختلف رمز کننده اندوگلوکانازی، طراحی آغازگرها از نواحی کمتر حفاظت شده انجام شد تا احتمال تکثیر غیر اختصاصی در PCR کاهش یابد. شرایط بهینه PCR از نظر دمای اتصال آغازگر به رشته الگو تعیین گردید به طوری که برای جفت آغازگر مربوط به Egl1،دمای اتصال 52 درجه سانتی‌گراد و برای Egl2 56 درجه سانتی گراد تعیین شد. فراورده‌های حاصل از PCRبر روی ژل یک درصد آگارز بارگیری شده و توسط اشعه UV آشکار سازی شدند.انطباق کاملی بین نتایج حاصل از بیماریزائی جدایه‌ها در شرایط گلخانه‌ای و الگوی نواربندی الکتروفورزی مشاهده نگردید. با توجه به فعالیت سلولازی این آنزیم‌هاو نقش آنها در تجزیه دیواره سلولی گیاهان، شاید بتوان نتیجه گرفت که این دسته آنزیم‌هاجزء آنزیم‌های عمومی در این پاتوژن بوده و احتمالا توسط تمامی جدایه‌ها تولید می‌شود.
آغازگر برگشتی آغازگر روبه جلو
5'-ACG TTC CAT CAA GAT GTT G-3' 5'-AGT GCA AAA GGA AGA GAA GC-3' Egl1
5'-ACG CCG CCG CAG AGC CAT TAT C-3' 5'-AAC GAC CAG TTC GTC TCG-3' Egl2
همچنین بر اساس نتایج هم‌ردیفی چند گانه بین ژن‌های مختلف رمز کننده اندوگلوکانازی، طراحی آغازگرها از نواحی کمتر حفاظت شده انجام شد تا احتمال تکثیر غیر اختصاصی در PCR کاهش یابد. شرایط بهینه PCR از نظر دمای اتصال آغازگر به رشته الگو تعیین گردید به طوری که برای جفت آغازگر مربوط به Egl1،دمای اتصال 52 درجه سانتی‌گراد و برای Egl2 56 درجه سانتی گراد تعیین شد. فراورده‌های حاصل از PCRبر روی ژل یک درصد آگارز بارگیری شده و توسط اشعه UV آشکار سازی شدند.انطباق کاملی بین نتایج حاصل از بیماریزائی جدایه‌ها در شرایط گلخانه‌ای و الگوی نواربندی الکتروفورزی مشاهده نگردید. با توجه به فعالیت سلولازی این آنزیم‌هاو نقش آنها در تجزیه دیواره سلولی گیاهان، شاید بتوان نتیجه گرفت که این دسته آنزیم‌هاجزء آنزیم‌های عمومی در این پاتوژن بوده و احتمالا توسط تمامی جدایه‌ها تولید می‌شود.
کلیدواژه ها