همسانه‌سازی، بررسی فیلوژنتیکی و نوترکیبی ژن کامل نوکلئوکپسید و بخشی از ژن پلی‌مراز ویروس پژمردگی لکه‌ای گوجه فرنگی

عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران

ویروس پژمردگی لکه‌ای گوجه‌فرنگی (Tomato spotted wilt virus (TSWV)) از جنس توسپوویروس و خانواده (بنیاویریده) Bunyaviridae است که سبب خسارت زیادی در مزارع گوجه‌فرنگی دنیا و ایران می‌شود. پیکره این ویروس ایزومتریک و ژنومش متشکل از سه آران‌ای تک-رشته‌ای است، قطعه بزرگتر بنام L ژن پلی‌مراز را رمز می‌نماید که قطبیت منفی دارد و دو قطعه دیگر بنام‌های M و S هستند که حالت دو قطبی (Ambisense) دارند. ژن رمز کننده نوکلئوکپسید روی قطعه S وجود دارد. در این مطالعه، به منظور ردیابی توسپوویروس‌های آلوده کننده مزارع گوجه‌کاری استان زنجان، نمونه‌برداری در سال زراعی ۹٣-۹٢ به صورت انتخابی از گیاهان دارای علائم مشکوک به ویروس انجام شد. آران‌ای کل از بافت‌های برگی جمع‌آوری شده توسط کیت استخراج آران‌ای RNX PLUS انجام گرفت، پس از ساخت دی‌ان‌ای مکمل cDNA، آزمون پی‌سی‌آر با استفاده از یک جفت آغازگر عمومی جنس توسپوویروس‌ها ( gl3637(آغازگر رفت) و gl4435c (آغازگر برگشت)) برای ردیابی جنس توسپوویروس و جفت آغازگر اختصاصی TSWV F (آغازگررفت) و TSWV R (آغازگر برگشت) برای تکثیر ژن نوکلئوکپسید TSWV انجام شد. نتایج نشان داد قطعه 819 bp مربوط به بخشی از ژن پلی‌مراز (RdRp) قطعه L توسپوویروس‌ها و قطعه 777 bp مرتبط با ژن نوکلئوکپسید در ۱۳ نمونه گیاهی تکثیر یافت. برخی از قطعات تکثیر شده (ژن پلی مراز و نوکلئوکپسید) بصورت انتخابی در پلاسمید همسانه‌سازی pTG19-T (Vivantis) الحاق گردیدند. پلاسمیدهای نوترکیب به باکتری‌های مستعد Escherichia coli سویه DH5α ترانسفورم و پس از رشد شبانه، کلون‌های سفید برای بررسی قرار گرفتن قطعه درون پلاسمید انتخاب شدند. استخراج پلاسمید با استفاده از کیت (AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini; Bioneer Company) از کلونی‌های رشد یافته در محیط مایع LB انجام گرفت. پس از بررسی صحت درج قطعه درون پلاسمید pTG19، پلاسمیدهای نوترکیب برای تعیین ترادف نوکلئوتیدی به شرکت بایونیر کره جنوبی ارسال شدند. سپس توالی هر قطعه بدست آمده با توالی‌های موجود در بانک ژن مقایسه شدند که نتایج نشان داد قطعات تکثیر یافته متعلق به ژن‌های پلی مراز و نوکلئوکپسید ویروس پژمردگی لکه‌ای گوجه‌فرنگی می باشند. همردیف‌سازی توالی بدست آمده با استفاده از برنامه Clustal W با سایر توالی‌های موجود در بانک ژن انجام گرفت و درخت فیلوژنتیکی مناطق ژنومی مورد نظر توسط برنامه MEGA 6 و با روش Neighbor-joining رسم گردید. در آنالیز درخت فیلوژنتیک، براساس ژن پلی‌‌مراز، جدایه‌ ردیابی شده به جدایه‌های ایرانی TSWV نزدیک بوده و با جدایه TOS-6 این ویروس در یک گروه قرار می‌گیرند. شباهت بین ژن‌نوکلئوکپسید جدایه‌های ایرانی و دیگر جدایه‌های گزارش شده ۹۶-۹۹% و شباهت توالی‌های اسیدآمینه بین ایزوله‌های ایرانی و دیگر ایزوله‌ها ۹۸-۹۹% ، و نزدیکی ایزوله‌های ایرانی به ایزوله SC-13 از ترکیه را نشان داد. رخدادهای نوترکیبی با روش Maxchi در برنامه RDP 4 شناسایی شدند. آنالیز نوترکیبی شواهدی از نوترکیبی ژن نوکلئوکپسید ایزوله‌های با سایر جدایه‌های گزارش شده (TOS101/TSWV-1423/3906) از دنیا را نشان می‌دهد.

واژه‌های کلیدی: استان زنجان؛ پلاسمید نوترکیب؛ توسپوویروس؛ واکنش زنجیره‌ای پلی مراز