جداسازی و شناسایی باکتری Serratia marcescens از کرم سفید ریشه Polyphylla olivieriو بررسی بیماری‌زایی این باکتری بر روی شب‌پره‌ی هندی آرد Plodia interpunctella (Hunber)
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
طی نمونه برداری حشرات از باغات میوه‌ی سیب روستای انار شهرستان مشگین‌شهر، استان اردبیل، لاروهای آلوده‌ی کرم سفید ریشه جمع-آوری و به آزمایشگاه انتقال داده شد. پس از ضد عفونی سطحی، نمونه گیری از همولنف حشره آلوده انجام گردید و در پلیت های حاوی محیط باکتریایی LB Broth (Miller)، کشت داده شد. به منظور رشد کلنی‌های باکتری، پلیت‌ها در دمای 27 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار گرفت. درتمامی پلیت های کشت، کلونی های قرمز مایل به نارنجی مشاهده شد و خالص‌سازی گردید. به منظور شناسایی مولکولی باکتری، استخراج DNA از کشت خالص باکتری به روش فنول-کلروفرم انجام گردید و برای واکنش PCR مورد استفاده قرار گرفت. واکنش PCR با استفاده از پرایمرهای عمومی باکتریایی انجام شد و 1500 نوکلئوتید از ژن 16S rRNA و 1000 نوکلئوتید از ژن GroEl تکثیر شدند. قطعات تکثیر شده از ژل آگارز خالص‌سازی شدند از دو طرف تعیین توالی گردید. نتایج آنالیز بلاست این ژن‌ها، شباهت زیادی (%99) با S. marcescens نشان داد. درخت‌های فایلوژنی ژن‌های مذکور با روش‌های بیشینه شباهت و بیشینه صرفه‌جویی این باکتری را در کلاد Serratia با بوتسترپ بالا قرار داد. این نتایج، گونه S. marcescens را برای ایزوله‌ی جداسازی شده تایید کرد. تست‌های بیوشیمایی نشان داد که این باکتری توانایی تخمیر لاکتوز را ندارد، که از ویژگی بارز این گونه است. به‌منظور بررسی بیماری‌زایی روی لارو سن پنج حشره شب‌پره‌ی هندی آرد، شش غلظت از باکتری تهیه گردید. زیست‌سنجی با روش های تزریق سلول‌های باکتری به همولنف لارو و آلوده‌سازی ماده‌ی غذایی انجام گردید. برای زیست‌سنجی به روش آلوده‌سازی ماده‌ی غذایی، لاروهای حشره به‌مدت 24 ساعت در شرایط بدون غذا قرار گرفتند، سپس 10 میکرولیتر از هر یک از غلظت‌ها برداشته شد و با 100 میلی-گرم از ماده‌ی غذایی آفت مورد نظر مخلوط شده و در دسترس لاروها قرار گرفت. این آزمایش در شش تکرار انجام گرفت. بیشترین غلظت (107×4) و کمترین غلظت (103×4) مورد استفاده در 24 ساعت به ترتیب منجر به 33/93 و 33/13 درصد مرگ‌و‌میر شدند. در زیست‌سنجی به روش تزریق‌کردن سلول باکتریایی، مقدار یک میکرولیتر از هر غلظت انتخابی بوسیله‌ی سرنگ همیلتون به همولنف لارو حشره تزریق گشت. بالاترین و هم پایین‌ترین غلظت در شش ساعت پس از تزریق به‌ترتیب 100 و 67/6 درصد از جمعیت را از بین بردند. همچنین، تزریق مایع رونشین کشت S. marcescens به همولنف لاروها منجر به خونریزی ادامه‌دار از محل تزریق گردید که نشان دهنده‌ی مهار سیستم ترمیم زخم لاروها بود. نتایج نشان داد که این باکتری قادر به ایجاد بیماری‌زایی و خاصیت ضد انعقاد خون بر روی لارو این حشره را داشته و می‌تواند در برنامه‌های کنترل میکروبی این آفت مخرب مورد استفاده قرار گیرد.
کلیدواژه ها