تعیین محل استقرار داخل سلولی عمل‌گر WBDLEff64 از ژنوم فیتوپلاسمای جاروک لیموترش در گیاه Nicotiana benthamiana با روش بیان گذرا
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
کرامت اله ایزدپناه ، امنه عنابستانی ، مارتینا مورانو ، سابرینا پالمانو ، آندرآ کارا ، مارتا والینو ، کریستینا مرزاکی
چکیده
باکتری‌های بیمارگر گیاهی از راهبردهای اختصاصی جهت ایجاد بیماری در میزبان خود استفاده می‌کنند. از عامل‌های مهم بیمارگری در آن‌ها می‌توان به پروتئین‌های عمل‌گر اشاره کرد. در مطالعات قبل چندین عمل‌گر از ژنوم فیتوپلاسمای جاروک لیموترش شناسایی و توالی یابی شده‌اند. به منظور بیان یکی از این عمل‌گرها، WBDLEff64، از ژنوم فیتوپلاسمای جاروک لیموترش در گیاه توتون و شناسایی محل استقرار داخل سلولی این عمل‌گر از روش بیان گذرا استفاده گردید. سازه مورد نظر با استفاده از فناوری Gateway ساخته شد بدین صورت که پرایمرهای اختصاصی ژن WBDLEff64 دارای دو توالی attB1 و attB2 در دو انتهای پرایمر طراحی شدند و این ژن با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز تکثیر شد. به منظور ساخت همسانه ورودی (entry clone) محصول PCR با استفاده از PEG خالص شده و در واکنش نوترکیبی (BP recombination) با پلاسمید دهندهpDNOR207 قرار گرفت. قطعه تکثیر شده در دو انتها دارای توالی‌های خاصی بوده که منجر به نوترکیبی با پلاسمید دهنده می‌شود. صحت توالی ژن مورد نظر با استفاده از توالی-یابی تایید شده سپس این ژن طی یک واکنش نوترکیبی دیگر (LR recombination) وارد پلاسمید مقصد pB7WG2-GFP گردید. این پلاسمید دارای ژن Green fluorescent protein بوده و با بیان این سازه محل استقرار پروتئین WBDLEff64 در سلول مشخص می‌گردد. جهت مایه‌زنی گیاهان توتون، سازه مورد نظر به سویه GV3101 از باکتری Agrobacterium tumefasciens منتقل شد. سازه مورد نظر با روش Agroinfiltration به گیاهان توتون در مرحله 4 برگی مایه‌زنی شده و پس از گذشت 72 ساعت بیان پروتئین مورد نظر با استفاده از میکروسکوپ هم کانون بررسی گردید. گیاهان بیان کننده سازه GFP-WBDLEff64 در مقایسه با گیاهان بیان کننده پروتئین GFP به تنهایی، بیان بالایی را در سطح سلول‌ها نشان دادند. بیان پروتئین WBDLEff64 در سلول بیشتر در ارتباط با اندامک‌های غشادار از جمله شبکه آندوپلاسمی و همچنین در ارتباط با غشای هسته و غشای سلول می‌باشد. استقرار بیشتر این پروتئین بر روی غشای هسته نسبت به داخل هسته و همچنین بر روی غشای شبکه آندوپلاسمی در اطراف هسته نشاندهنده عملکرد این پروتئین در این نواحی می‌باشد. در صورتی که پروتئین GFP به تنهایی در تمام قسمت‌های سلول به طور یکنواخت بیان شده بود. به طور کلی می‌توان نتیجه گرفت که محل عملکرد پروتئین WBDLEff64 در سیتوپلاسم سلول بوده و تجمع کمتر آن در هسته این نتیجه را تایید می کند. به منظور تعیین عملکرد این پروتئین در این مکان‌ها نیاز به مطالعات بیشتری است که می‌توان از این اطلاعات در راستای مقابله با فیتوپلاسمای جاروک لیموترش استفاده کرد.
کلیدواژه ها