همسانه سازی و تنوع ژنتیکی ژن 2AHPویروس برگ بادبزنی مو

عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران

ویروس برگ بادبزنی مو متعلق به جنس Nepovirus از خانواده Secoviridae است. این نپوویروس در تاکستان‌های سراسر جهان که انگور کشت می‌شود، بروز می‌کند و توسط نماتد انگل خارجی Xiphinema index انتقال می‌یابد. هر یک از مولکول‌هایRNAی ژنومی یک پلی‌پروتئین رمزگردانی می‌کند. RNA2 پلی‌پروتئین P2 را رمز می‌کند که به پروتئین‌های 2AHP، حرکتی و پوششی هضم می‌شود. پروتئین 2AHP در همانند سازی RNA2 نقش دارد. تنوع ژنتیکی ژن‌های حرکتی و پوششی جدایه‌های ایرانی GFLV در برخی مناطق ایران به خصوص استان‌های شمال غرب مورد بررسی قرار گرفته‌اند، اما این اطلاعات در مورد ژن2AHP بسیار کم است. این پژوهش، به منظور تعیین تنوع ژنتیکی و همسانه سازی ژن 2AHP نخست، توالی‌های موجود در بانک اطلاعاتی GenBank با استفاده از نرم افزار Clustal W زیرهمچینی و سپس بر اساس بخش‌های ابتدایی و انتهایی ژن 2AHP چندین جفت آغازگر دژنره‌ی توسط نرم افزار Primer3 طراحی شدند. نمونه‌های برگی انگور با علایم موزاییک زرد و رگبرگ نواری طی سال‌های 94-1393 از استان‌های آذربایجان شرقی، زنجان و قزوین جمع‌آوری شدند و RNAی کل آن‌ها استخراج شد. حدود 100 نانو گرم از RNAی کل استخراج شده با جفت الیگونوکلئوتیدهای طراحی شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با نسخه‌ برداری معکوس (RT-PCR) استفاده شدند. محصولاتRT-PCR از ژل استخراج و به حاملpTG19 که یک حامل همسانه‌سازی A/T است، الحاق شدند. پلاسمیدهای نوترکیب به باکتری Escherchia coli انتقال یافت و پس از کشت در محیط کشت جامد دارای آنتی بیوتیک و مواد زمینه‌ای، همسانه‌های مورد نظر انتخاب و توالی ‌یابی شدند. نتایج نشان داد طراحی یک جفت آغازگر که به تنهایی ژن 2AHP را در تمامی جدایه‌های گزارش شده تکثیر نماید بسیار مشکل است و قادر نیستند این ژن را در تمامی جدایه‌ها تکثیر دهند. بنابراین نواحی حفاظت شده موجود در دو طرف ناحیه ژنومی2AHP برای طراحی پرایمر استفاده شدند. در نهایت دو جفت آغازگر شناسایی شدند که تکثیر ژن 2AHPبه همراه نواحی اطراف آن را به صورت موفقیت آمیز سبب شدند. اطلاعات حاصل از تعیین توالی نشان داد که ناحیه ژنومی 2AHP از نظر اندازه و توالی بسیار متنوع است. درخت فیلوژنتیک ترسیم شده براساس ژن2AHP در سطح اسیدهای نوکلئیک، تمامی 111 جدایه‌ی GFLV گزارش شده از دنیا به همراه دو جدایه تعیین توالی شده از ایران و شش جدایه تعیین توالی شده در این مطالعه را به شش گروه تقسیم کرد که طیف اندازه آ‌ن‌ها از 765 تا 798 نوکلئوتید بود، اما آن‌ها براساس آنالیزهای فیلوژنتیکی در سطح اسیدهای آمینه به هشت گروه تقسیم ‌شدند. در حالیکه انتهای آمینی پروتئین 2AHP منطقه بسیار متنوعی بود، در بیشتر جدایه‌ها منطقه مرکزی و انتهای کربوکسیل محافظت شده بودند. احتمالاً تنوع در ابتدای ژن 2AHP باعث عدم اتصال آغازگرها به آن می‌شود.

انگور؛ طراحی آغازگر؛ نپوویروس؛ فیلوژنی